光学显微镜中的计算超分辨(1)：光学成像基础

    只有用心看，才能看清楚。这是狐狸对漫游到地球的小王子说的，也让小王子终于发现，B612星球上那株跟他吵架的玫瑰，尽管不是天下最美的，却是独一无二被他“驯服（apprivoiser）”的玫瑰，他不应该离开她，他有责任永远爱她。

    重要的东西是眼睛看不见的，不仅是这份微妙爱意，更是承载TA的生命涌动：海马体细胞记忆了浇灌玫瑰的每个清晨、听视觉细胞带来了每个星球新奇的见闻、运动细胞给了小王子丈量宇宙的动力...细胞组成了我们，却是眼睛看不见的。为此，用心的先贤们发明了光学显微镜，带我们看到了细胞神奇的世界。

    然而，因为光学衍射极限，更重要的东西——神经元电火花的闪耀、蛋白质有序地来往、离子和谐地奔流——仍然远离我们的视界。有一批用心的人，利用荧光，带我们看到了超分辨的世界，荣膺2014年诺贝尔化学奖。这段故事几乎已（科学）家喻户晓。

    而与此同时，还有另一批用心的人，也在浇灌自己的玫瑰。TA们用另一种方式——知识建模与算法——殊途同归地提升光学显微镜的分辨率。相比于闪烁的荧光，这里闪耀的是理性的光芒。也最终浇灌出，独一无二的那一朵。

  本文是Tian W, Chen R, Chen L. Computational Super-Resolution: An Odyssey in Harnessing Priors to Enhance Optical Microscopy Resolution[J]. Analytical Chemistry, 2025.的通俗科普版，主题是对光学显微镜中计算超分辨方法的历史回顾。起因之一是计算超分辨近来颇放光彩，但对之的误解不比理解浅，为此有一小总结，备为不察。不过原文太专业化，难以引起一般背景朋友的兴趣，因此有必要用通俗易懂的方式再做解释。

    因内容太长，拟分为三篇小文：

• 光学成像基础。引出显微镜之基本模型为分析分辨率做基础。
• 分辨率和超分辨概念。讲明显微镜为什么会有分辨率上限，核心是傅里叶变换关系。
• 计算超分辨。简介思想核心与各流派之演进。
  
  
  

    Richard Feynman说：“If you can't explain it to a six-year-old, you don't understand it yourself”。为了不以其昏昏使人昭昭，我努力以平实也不失准确的方式来做介绍。尽管让six-year-old听懂仍无希望，但对任何愿意用心看的人，绝不会困难。

    难免未有完备和错漏之处，好在，世界已经不同，ChatGPT和DeepSeek出现了。尽管目前仍无法避免产生“幻觉”，它们在一般水平问题上已经完全能胜任，（比如DeepSeek告诉我Richard Feynman根本没说过前面那句话）因此任何未尽解释之处都可以让大语言模型从旁辅助。

    正是你为你的玫瑰花费的时光，才使你的玫瑰变得如此重要。超分辨、超分辨显微镜、计算超分辨知识本身都只是科学世界一小株玫瑰，但先贤们浇灌其上的智慧和勇气，只有用心看，才能看清楚。

要有光

    我们先从给一颗树拍照开始。

    拿起相机对准目标，“咔嚓”，我们就可以得到一张树的照片。这个我们习以为常的过程背后有许多有趣的问题。

    首先，我们拍的是什么呢？表面上看拍的是这棵树本身，但是如果在夜晚，拍出来会是黑漆漆一片，只有打开闪光灯才能再次得到正常照片。这说明，只有目标是不够的，我们要有一种东西来把目标的信息呈现出来。在这里，我们拍的实际上是光。

    这引出更多问题，光是什么？如何让光显示出目标（这棵树）的样子？如何记录光？

    我们先假设其他问题都已解决——树可以自己发出光，并且我们有办法记录光——只考虑“如何让光显示出目标（这棵树）的样子？”这个问题。

直接成像 引自[1]

    那么，考虑如图树上的三个点A，B，C，它们每个都会向四面八方发出光，并且光沿直线传播（也作为已知知识，尽管这背后有很复杂的物理含义）。我们在合适的地方放上一块可以记录光的面，如果此时我们同样“咔嚓”一下，会拍到一副树的图像吗？答案是否定的，否则相机就不需要存在了。为什么呢，以记录平面上A'点为例，它不仅会记录到A点的光，还有B和C点，那么怎么能分清这是来自树尖、树梢还是树干的光呢？其他点也是一样，所以最后当然拍到的是模糊一片。

小孔成像 引自[1]

几千年前就有先贤想到了在中间如果加上一个小孔，情况就大不一样。如图，有一张只在中间开有一个小孔的木板挡在了树和记录平面中间，此时，从A点虽然发出了四面八方的光，但是因为光沿直线传播，只有一束光能够穿过小孔到达A'，其他光都被挡住了。反过来，在A'，也只会接收到从A点发出来的光，不再像前一个情况里会接收到B，C点的光。树尖的光只会在一个点成像，树梢和树干也一样，那么，再次“咔嚓”，我们有理由拿到一张树的图像。这就是下图针孔相机的原理。（引自维基百科）

    由此可见，只要做到“点与点一一对应”就可以成像。

    但是，这无疑降低了光的利用效率，A点发出那么多光线，除了一条被收集其他的都被挡住了，所以拍出来的图像会非常暗甚至根本无法拍清楚。如果能够让A点发出的所有光“汇聚”到A'，就可以解决这个问题了。

    为此，透镜诞生了。透镜可以把从焦点发出的四面八方的光都汇聚为平行光，或者反过来，把平行光汇聚到一个焦点。

    于是只要将目标和记录平面放到合适的位置，透镜就会将目标一个点发出的光汇聚到同一个点。这样用透镜取代小孔，就得到了单透镜成像。

单透镜成像 引自[1]

    这提高了小孔成像的效率。我们都应该最熟悉单透镜成像，因为我们的眼睛就是这样拍照的。

     从这个意义上说，我们的眼睛跟显微镜没什么本质不同。但我们的眼镜看不清细胞，因为放大倍数还不够大。而放大倍数是物距像距决定的，那么只要几何关系设计合适，的确可以将很小的物体放到很大，这样就有可能看清人眼无法看到的微小事物。

    很自然地，只要把这棵树换成细胞，把记录平面换成人眼，保证有光照着，然后——精心打磨透镜，让它可以放大很多倍，就得到了早期的显微镜。引自[2]

列文虎克显微镜复原，网图

    不过，单透镜成像仍然有缺陷，其中之一是太固定不够灵活。于是进一步的改进是使用两个透镜：将目标放在第一个透镜的前焦面，将记录面放在第二个透镜的后焦面。这样，从目标上一个点发出的光会被第一个透镜汇聚为平行光，再被第二个透镜汇聚为一个点，这样也做到了“点与点一一对应”，也可以成像。而且更加灵活，两个透镜的相对距离可以任意调节。因为常用f来表示焦距，这个双透镜系统被称为4f系统。

4f系统

    事实上，这就是现代显微镜核心光路设计，不管多复杂的显微镜，其内部都有很多4f系统元件。另一方面，现代显微镜可以整体被抽象为一个简单的4f系统，如下图。

现代显微镜抽象模型  

    尽管光学系统还经历了复杂的更新，但对于本文来说，抽象为4f系统就够了。到这里，基本解决了“如何让光显示出目标的样子？”这个问题。

抓住光

    现在我们就要回过头来研究：光是什么？如何记录光？

    遗憾的是，关于“光是什么”这个问题，我们无法在此深究，现代物理在这个问题上已经走得太远。参考阅读：《光到底是什么|中科院物理所》

图片来自网络

    但是，站在巨人的脑袋上，我们可以直接来到结论部分：在不同尺度下，光的样子是不同的。

光的不同形态，引自[3]

    当目标尺度远大于光的波长（比如拍一棵树）可以很安全地将光考虑为直直的光线（上图d）。

    而当目标尺度远小于光的波长时，光是一系列粒子“光子”的集合（上图a）。其实我们每天都在“看见”光子！人眼之所以能够感受光，是因为视网膜上的感光细胞（过去只有视杆细胞和视锥细胞，但是近来已经发现第三种感光细胞），更具体地说，是细胞上的感光蛋白，可以吸收光子转化为电信号刺激神经。rhodopsin这种G蛋白偶联受体就是一种。有研究表明，即使一个光子，都可以让人眼有感觉[4]。另外，感光蛋白这种能力还催生了伟大的光遗传学。 参考阅读：《光遗传学背后的科学家们》

    幸好，在细胞尺度上，光的物理性质没有那么匪夷所思。

    当目标尺度与光的波长相当时，光是一种电磁波。这是一般大学物理或者电磁学课程最末一节的结论，而推导出这个结果曾是众多先贤对人类智力巅峰的一次展示。

    同样，我们直接来到结论。对于一般显微镜，这就够了。最基本的光长这个样子[3]：

    “最基本”的含义是，其他任何奇形怪状的光的样子都可以被一系列这样的最基本的光合成——这就是第二部分将介绍的傅里叶光学的核心。

    如果我们只看那个箭头——也就是光前进的方向，跟光线模型是一样的。但是，光并不是分布在前进方向上的，它其实是“横着”的。想象你用手抖动一根长绳产生的波浪——光的传播就像这样的横波。当光向前飞驰时，它的能量其实是在「左右甩动」（图中红色的磁场）和「上下翻腾」（图中蓝色的电场）。光的电场与磁场始终垂直，并且不需要外力甩动，它们自己会相互激发，让光波不断向前。不过，因为电场比磁场强得多，一般就用电场指代光，常用字母E表示。当目标尺度太大，横波的幅度相对就会变得很小，以至于可以被忽略，波的模型就退化为了光线。

    当然，多么精妙的描述都不如看看动图来的直接（引自维基百科）：

    在数学上，这种波可以用正弦函数来描述，但我们放到第二部分再介绍。

    接下来，我们就可以考虑下如何记录光了。其实这个问题更本质的问法是，光是如何携带目标信息的？光携带的信息决定了我们应该如何去记录它。你不能拍出一块透明玻璃，却可以拍到一棵树，说明光携带的信息是不同的。这个信息也被称为图像的对比度（Contrast）。

    可以类比一下，假如有一大块橡皮泥，如何用来记录我们右手手掌的形状呢？如果一开始是一块刚拆封下来完美的长方体橡皮泥，我们可以把手盖上去再拿起来，然后观察橡皮泥上面的凹陷，得出手掌的形状；另一种方式是我们把任意形状的橡皮泥敷到手掌上，铺的严严实实的，然后再取下来，那么这块橡皮泥本身就呈现了手掌的样子。

    所以我们有两种方案，一种是对目标发射一束已知形状的参考光——可以就想象成是刚拆封下来的方形橡皮泥——然后通过目标，光就会发生变化，只要记录下来变化就可以得到目标的样子了。另一种方案是用某种办法使得目标携带可以发出光的东西——把橡皮泥敷上去——那么此时光本身就长成目标的样子了，我们只需要记录下来光的样子就得到了目标的样子。

    让我们先来看第一种方案。通过目标后，光会发生什么变化？

    生活中，我们能看清一棵树，却看不到玻璃；树叶是绿色的，树干是褐色的；阳光刺眼，但是同样来源于日光的月光柔和...

    由此可见，光经过不同的目标，发生的变化也不同：透明度、颜色、强度...用科学一点的话说，光有许多维度：

光的不同维度，引自[5]

    让我们回到描述光作为电磁波的那根“抖动的绳子”，并且认准，横波的最大值处称为波峰。如果抖动得快一点，光的两个波峰之间的距离就会变短，这个维度叫做光的“频率（Frequency）”；如果用力大一点，光的波峰就会更大，这个维度叫做光的“振幅（amplitude）”；如果偏一个角度抖动，这个维度叫做光的“偏振（Polarisation）”；而波峰在光线上有相对位置，这个维度被称为光的“相位（Phase）”；这说的都是一个完美的正弦波，但实际中的光是许许多多不同正弦波叠加起来的，因此在时间（time）和空间(space)上可以有无穷无尽的变化。这构成了上图的各种维度。

    光通过物体，以上维度都可能会发生变化，但是对光学显微镜来说，最显著的变化是两个维度上的：振幅和相位。光在通过充满分子的细胞时，会被吸收和散射。吸收意味着有光子被细胞“吃掉了”，因此造成抖动绳子的力度衰减（振幅下降）；散射类似于光子被弹开，原本步伐整齐的光子流就会出现步调不一致，出现相对位移（相位变化）。这两个现象都携带了目标的信息。

    于是要给细胞拍照，我们只需要用一束光照到细胞上。这束光的振幅和相位就会根据遇到的目标不同而发生变化，如下图所示：

引自[6]，图a显示照给细胞的光，图b显示经过目标只发生振幅降低的情况，图c表示只发生相位变化的情况，图d是振幅和相位都变化的情况

    前面介绍过，人眼是靠对光子的吸收看见物体的，这对应了光的振幅性质（更准确地说是呈平方关系，被称为强度（intensity））。太阳光被自然物体反射发生振幅变化，我们才得以看清世界。而世界之所以多彩，是因为光的频率不同。

    相机能够记录光，也是依靠光的振幅变化。依靠光与特殊物质（比如卤化银）的光化学反应，可以把振幅变化转化为物质变化。如果要记录色彩，可以用多层感光物质。后来发明了电子器件，可以将光的振幅变化转化为电子信号变化，形成了现代相机。

     至此，给树拍照已经解决，看上去用同样的方式给细胞拍照也不成问题——如果所有细胞都对光有显著吸收的话。

    然而，事实并非如此。很多细胞几乎不吸收可见光，因此光在经过时振幅并不会有太大的变化，反而是相位的变化更加显著。遗憾的是，无论是人眼还是相机，都对相位变化不敏感。我们看不到玻璃窗，很大部分原因就是因为人眼无法看到相位变化。换句话说，这些细胞是透明的！

    这个问题长期困扰着显微领域。那时唯一的解决办法是对细胞染色，但这会杀死细胞。直到1934年泽尼克发明了相衬显微镜。他将一块特殊相位板插到光路中，引入额外的相位变化，将相位信息转化为强度变化，终于可以直接看清细胞。如下图（b）所示。

引自[7]，DIC和Hoffman是另外两种精妙的将相位信息可视化的显微成像

    这一发明在今天看来似乎并不那么惊世骇俗，但这只是因为我们已经站在了前人的成就之上。1953年，泽尼克就因为发明相衬显微镜获得了诺贝尔物理学奖。

    用一块橡皮泥把手掌印上去，这样的方式当然很直接，但是如果我们只想研究手掌上特定的部分，更好的方式是把橡皮泥敷到这些地方，特异性地把形状描摹下来。对显微镜来说，这一点至关重要，否则我们分不清每一部分到底对应什么东西。此时给细胞打上一束均匀的光并不是好的办法，只需要让特定的部分发光就行了。

    直到20世纪中期，人类才找到能够让细胞自己发光的办法——荧光蛋白，关于这段故事也已经成绝唱。参考阅读：饶毅：美妙的生物荧光分子与好奇的生物化学家[8]

    但荧光在光学成像非常特殊，前面介绍过，我们没办法很好地记录相位信息，而荧光从一开始就不携带相位信息，因为它是非相干光。其结果就是，我们可以很安心忽略相位，只需要记录荧光强度就够了。这一点对于分辨率有决定性的影响，我们将在第二部分介绍。

光的游戏

    至此，我们可以发现，光学成像的核心就是两部分，对比度（Contrast）——光携带目标什么样的信息，和光路——如何让光携带的信息呈现目标的样子。

      荧光显微镜，就是以荧光为Contrast的各种光路设计。光路可以自由组合，因此奇思妙想层出不穷，诞生了千变万化的各种荧光显微镜，就像是一个智力游戏场。

各式各样的荧光显微镜设计，引自[9]

    想要对多姿多彩的荧光显微镜有更多了解，欢迎选修陈老师荧光显微成像课程。

分辨率的困境

    到现在，一切都很完美。既然放大倍率取决于物距像距的关系，那么，如果不断打磨更好的透镜，放大像距物距比，我们不是可以将越来越小的东西成像？不仅细胞，细胞器，甚至大分子、原子...

    十九世纪中叶，制镜工人们的确是这样想的。当时细胞学说刚刚诞生，市场急需看细胞更清楚的透镜。然而，无论他们多么努力认真地打磨，成像清晰度都处在瓶颈中。

    在荧光显微镜下更加直观，单个荧光蛋白在显微镜里呈现着一块大约200纳米大小的光斑，无论多么精密的光路都无法解析。

增强型绿色荧光蛋白（EGFP）及其物理尺寸与荧光显微镜成像尺寸的对比，引自[3]

     为什么，显微镜的分辨率不能无限提高？

   历史上，显微镜领域两位巨人——Carl Zeiss，Ernst  Abbe，也是蔡司公司的共同创始人——的合作揭开了这一难题。

参考阅读：蔡司、阿贝以及显微镜和光学研究的故事[10]

    简单地说，即使做出一个地球那样大的显微镜，也没有办法从根本提高显微镜的分辨率。相反，一个有效的提高分辨率的办法是简单地把显微镜片做大。但这也是有上限的。

    阿贝第一次从理论上刻画了这个上限，而且简洁到发指，仅仅是一个公式，优美到可以直接刻在他的纪念碑上：

图片源自网络

    就是这个公式，将分子间的偶然碰撞，细胞信号的瞬时传递，基因中的微小变化都束缚在模糊的光斑下。

    在第二部分，我们将用现代信号理论重新解释阿贝理论，解释为什么显微镜会有分辨率上限，以及超分辨的含义。在此基础上，第三部分将介绍计算超分辨如何通过另一种奇思妙想来提高分辨率的。